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上期給大家匯總了一些有關(guān)蛋白質(zhì)測序原理的基礎知識，這期著(zhù)重給大家列舉一些蛋白質(zhì)測序實(shí)驗中新手可能想問(wèn)的問(wèn)題，希望對網(wǎng)接觸蛋白質(zhì)測序的實(shí)驗新手在選擇蛋白質(zhì)測序方法上有指導性幫助。

1-. 蛋白質(zhì)樣品純度較高，有什么快速的蛋白質(zhì)測序的方法嗎？

可以通過(guò)鑒定蛋白質(zhì)的肽譜圖（Peptide mass fingerprinting，PMF）達到快速測定蛋白質(zhì)測序的目的。因為每個(gè)蛋白質(zhì)的序列是特異的，經(jīng)過(guò)特定酶切產(chǎn)生的多肽的質(zhì)量也是一定的，因此，可以利用這一特性，通過(guò)測定蛋白質(zhì)酶切后產(chǎn)生的多肽的質(zhì)量圖譜，即測定蛋白質(zhì)肽譜圖，再與數據庫蛋白質(zhì)酶切的理論肽譜圖進(jìn)行比對，從而推斷出蛋白質(zhì)的序列。

2. 蛋白質(zhì)肽譜圖鑒定是基于哪項質(zhì)譜技術(shù)？

測定肽混合物質(zhì)量數有效的質(zhì)譜儀是MALDI-TOF-MS（基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜，英文名Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry），靈敏度高，譜峰簡(jiǎn)單，每個(gè)譜峰代表一種肽段。MALDI-TOF-MS分析肽混合物時(shí)，能耐受適量的緩沖劑、鹽，而且各個(gè)肽片幾乎都只產(chǎn)生單電荷離子，因此MALDI-TOF成為進(jìn)行分析PMF的s_h_ǒ_u|選方法。

3. 肽譜圖鑒定的優(yōu)缺點(diǎn)？

通過(guò)測定蛋白質(zhì)肽譜圖分析蛋白質(zhì)序列的方法的優(yōu)勢在于此項技術(shù)只用經(jīng)過(guò)以及質(zhì)譜分析來(lái)對蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，測定的速度較快，而且因為蛋白質(zhì)序列的特異性，肽譜圖法可以推斷出可信度較高的蛋白質(zhì)，也較為精準。但是由于肽譜圖測定需要依賴(lài)數據庫信息比對，因此，對于數據庫不包含的蛋白質(zhì)，肽譜圖不能夠進(jìn)行準確分析。

4. 準確度高的蛋白質(zhì)測序法有哪些？

雖然理論上蛋白質(zhì)酶切產(chǎn)生的肽段圖譜是特定的，但是影響蛋白質(zhì)酶切，以及鑒定肽段質(zhì)量的因素眾多，因此，肽譜圖對蛋白質(zhì)測序來(lái)說(shuō)還是一種比較粗略的測定方法，更為精準的蛋白質(zhì)測定方法包括Edman降解測序法，串聯(lián)質(zhì)譜測序法等。

5. 如果蛋白樣品中含有多個(gè)蛋白質(zhì)，有什么方法可以一次性對所有蛋白質(zhì)進(jìn)行測序的嗎？

MS/MS質(zhì)譜鑒定可以檢測一個(gè)蛋白條帶中的多個(gè)蛋白質(zhì)，只需要將蛋白膠切下來(lái)送測序即可，在這個(gè)過(guò)程中保證切膠使用的刀具是干凈無(wú)污染的，同時(shí)避免切下旁邊的雜蛋白。質(zhì)譜鑒定公司會(huì )對膠樣中的蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切，再測定肽段序列，然后將肽段序列與已知蛋白數據庫進(jìn)行比對，即可獲知膠樣中蛋白質(zhì)的ID，并推測出蛋白的序列。

6. Edman降解法能夠對所有蛋白質(zhì)進(jìn)行測序？

Edman降解測序法的優(yōu)勢是能夠對未知的蛋白質(zhì)進(jìn)行測序，目前這項技術(shù)已經(jīng)近乎完善，但是Edman也有一定的局限性。例如，Edman講解法測序不能夠解決蛋白質(zhì)N端環(huán)化、封閉的測序問(wèn)題，另外被修飾的蛋白質(zhì)不能給出確切的信號，這些都在一定程度上限制了Edman降解法的廣泛應用。

7. 對未知的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，如果蛋白質(zhì)的N端有環(huán)化封閉現象，或者N端有未知修飾時(shí)，如何對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行準確分析呢？

對于序列未知的蛋白質(zhì)，特別是經(jīng)過(guò)改造后的重組蛋白質(zhì)，體外合成蛋白質(zhì)，以及改造的抗體，或者基因序列未被研究過(guò)的蛋白質(zhì)，這類(lèi)蛋白質(zhì)的信息往往不包含在蛋白質(zhì)數據庫中。要實(shí)現對這類(lèi)蛋白質(zhì)序列的準確分析就必須通過(guò)蛋白質(zhì)從頭測序的方法。蛋白質(zhì)從頭測序法是一項基于質(zhì)譜技術(shù)的分析方法。與傳統質(zhì)譜鑒定的方法類(lèi)似，從頭測序法也是先將蛋白質(zhì)酶切成小的多肽片段，接著(zhù)經(jīng)由高效液相色譜對多肽片段進(jìn)行分離，再依次通過(guò)兩級質(zhì)譜對多肽片段序列進(jìn)行測定。相較于傳統質(zhì)譜測序，從頭測序經(jīng)過(guò)精密的算法，保證鑒定的多肽序列，能夠高準確度推導的蛋白質(zhì)序列，并且能夠不依賴(lài)于數據庫比對，實(shí)現蛋白質(zhì)序列從頭測定。

8. 如何對蛋白質(zhì)測序結果進(jìn)行驗證？

如果一個(gè)蛋白質(zhì)的序列被成功鑒定了，那么Western blot是很好的驗證方法。由于Western blot方法的特異性和靈敏度，因此，通過(guò)Western blot驗證的蛋白質(zhì)幾乎可以1_0_0_%確定蛋白質(zhì)鑒定的準確性，排出質(zhì)譜鑒定的假陽(yáng)性?？梢赃x取針對蛋白質(zhì)上面某一段序列制備的單克隆抗體進(jìn)行檢測，再將Western blot的結果與鑒定的蛋白序預計分子量進(jìn)行比對，即可確定蛋白質(zhì)測序結果的準確性。

9. 已知蛋白質(zhì)序列，如何對蛋白質(zhì)結構進(jìn)行預測？

蛋白質(zhì)結構預測，即從蛋白質(zhì)一級結構預測它的折疊和二級，三級和四級的蛋白質(zhì)結構。目前有兩種常用的蛋白質(zhì)結構預測的方法：1. 同源建模法，通過(guò)已知同源或同一家族中蛋白質(zhì)的結構，再對目標蛋白質(zhì)結構進(jìn)行推測；2. 折疊識別法，通過(guò)總結已知的蛋白質(zhì)折疊法作為目標蛋白質(zhì)折疊的模板，再根據數據庫推測出匹配的目的蛋白質(zhì)折疊的過(guò)程。

講了這么多實(shí)驗新手可能會(huì )關(guān)心的有關(guān)蛋白質(zhì)測序的問(wèn)題，但是大家實(shí)際遇到的問(wèn)題各有不同，我們在這里就挑選一下具體問(wèn)題進(jìn)行回答

1-. Edman降解測序是否可以測定含有大概130多個(gè)氨基酸的未知蛋白？

130個(gè)氨基酸序列比較長(cháng)，已經(jīng)超出了蛋白質(zhì)Edman測序的限度，建議使用蛋白從頭測序（de novo se）對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行測定。蛋白質(zhì)從頭測序不需要借助任何蛋白質(zhì)數據庫，可以對任何蛋白質(zhì)，包括突變、經(jīng)過(guò)生物改造的非天然蛋白質(zhì)等進(jìn)行測序。

2. 實(shí)驗中通過(guò)Western blot鑒定出一種目的蛋白，分子量約29KD，想直接跑單向SDS-PAGE,然后切膠進(jìn)行PMF，是否可行？PMF和Edman降解法那種更好？

使用SDS-PAGE分離，再將蛋白膠切下來(lái)做PMF是完全可行的。但是PMF比對的是肽譜圖，存在一定的假陽(yáng)性概率，因此對蛋白純度的要求較高。所以，建議SDS膠跑開(kāi)一些，保證切下來(lái)的蛋白膠不被其他蛋白膠影響，另外，切膠的時(shí)候注意不能被角蛋白等雜蛋白污染。PMF鑒定效率都比N端測序要更高，價(jià)格也更低。但是蛋白量、蛋白純度足夠高的話(huà)，PMF的結果也是同樣可信的。

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