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黑龍江干細胞外泌體提取暨南大學(xué)

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黑龍江干細胞外泌體提取暨南大學(xué)
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外泌體是指包含了復雜 RNA 和蛋白質(zhì)的小膜泡 (30-150nm),現今,其特指直徑在40-100nm的盤(pán)狀囊泡。
1983年,外泌體首次于綿羊網(wǎng)織紅細胞中被發(fā)現, 1987年Johnstone將其命名為“exosome”。
多種細胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體。
其主要來(lái)源于細胞內溶酶體微粒內陷形成的多囊泡體,經(jīng)多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中 。
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所有培養的細胞類(lèi)型均可分泌外泌體,且外泌體天然存在于體液中,包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁中。
有關(guān)他們分泌和攝取及其組成、“運載物”和相應功能的分子機制剛剛開(kāi)始研究。
外泌體被視為特分泌的膜泡,參與細胞間通訊,對外泌體的研究興趣日益增長(cháng),無(wú)論是研究其功能還是了解如何將其用于微創(chuàng )診斷的開(kāi)發(fā)。
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外泌體富含膽固醇和鞘磷脂。
2007年, Valadi等發(fā)現鼠的肥大細胞分泌 的 exosome可以被人的肥大細胞捕獲,并且其攜帶的mRNA成分可以進(jìn)入細胞漿中可以被翻譯成蛋白質(zhì),不僅僅是mRNA,exosomes所轉移的microRNA同樣具有生物活性,在進(jìn)入靶細胞后可以靶向調節細胞中mRNA的水平。
這一發(fā)現使得研究人員對exosome的研究熱情激增,截止已經(jīng)通過(guò)286項研究發(fā)現了41860種蛋白質(zhì)、2838種microRNA、3408種mRNA。
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一類(lèi)外泌體中常見(jiàn)的細胞質(zhì)蛋白是Rabs蛋白,是鳥(niǎo)苷酸三磷酸酶(GTPases,)家族的一種。
它可以調節外泌體膜與受體細胞的融合,有文獻報道稱(chēng)RAB4, RAB5和 RAB11主要出現于早期以及回收的核內體中,RAB7 和 RAB9主要出現于晚期的核內體。
現有大量的研究發(fā)現外泌體中含有40種RAB蛋白。
除了RAB蛋白,外泌體中富含具有外泌體膜交換以及融合作用的膜聯(lián)蛋白(包括膜聯(lián)蛋白1、2、4、5、6、7、11等)。
外泌體膜上富含參與外泌體運輸的四跨膜蛋白家族(CD63, CD81 和CD9))、
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熱休克蛋白家族((HSP60, HSP70, HSPA5, CCT2 和HSP90以及一些細胞特的蛋白包括A33(結腸上皮細胞來(lái)源)、MHC-Ⅱ(抗原提呈細胞來(lái)源)、CD86(抗原提呈細胞來(lái)源)以及乳凝集素(不成熟的樹(shù)突狀細胞)。
其它一些外泌體中的蛋白包括多種的代謝類(lèi)的酶(GAPDH, 烯醇化酶 1, 醛縮酶 1, PKM2, PGK1, PDIA3, GSTP1,DPP4, AHCY, TPL1, 抗氧化蛋白, P4HB, LDH, 親環(huán)素 A,FASN, MDH1 和CNP)、核糖體蛋白(RPS3)、信號轉導因子(黑色素瘤分化相關(guān)因子, ARF1, CD2, 人類(lèi)紅細胞膜整合蛋白, SLC9A3R1)、粘附因子(MFGE8、整合素)、細胞骨架蛋白以及泛素等。
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外泌體的提取主要包括以下幾種方式。
一是超速離心法,這是外泌體提取最常用的方法 。
此種方法得到的外泌體量多,但是純度不足,電鏡鑒定時(shí)發(fā)現外泌體聚集成塊, 由于微泡和外泌體沒(méi)有非常統一的鑒定標準,也有一些研究認為此種 方法得到的是微泡不是外泌體 。
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二是過(guò)濾離心, 這種操作簡(jiǎn)單、省時(shí),不影響外泌體的生物活性 ,但同樣存在純度不足的問(wèn)題。
三是密度梯度離心法, 用此種方法分離到 的外泌體純度 高,但是前期準備工作繁雜,耗時(shí),量少。

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黑龍江干細胞外泌體提取暨南大學(xué)四是免疫磁珠法,這種方法可以保證外泌體形態(tài) 的完整,特高、操作簡(jiǎn)單、不需要昂貴的儀器設備,但是非中性pH 和非 生理性鹽濃度會(huì )影響外泌體生物活性, 不便進(jìn)行下一步的實(shí)驗 。
五是PS親和法,該方法將PS(磷脂酰絲氨酸)與磁珠結合,利用親和原理捕獲外泌體囊泡外的PS。
該方法與免疫磁珠法相似,獲得的外泌體形態(tài)完整,純度。
由于不使用變性劑,不影響外泌體的生物活性,外泌體可用于細胞共培養和體內注射。
2016.9 《Scientific Reports》 雜志發(fā)表了該方法數據,表明PS法可提取相當高純度的外泌體。
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六是色譜法,這種方法分離到的外泌體在 電鏡下大小均 一, 但是需要特殊的設備 , 應用不廣泛 。
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